高效液相色谱技术（HPLC）-下

HPLC的特点和优点HPLC有以下特点：
高压——压力可达150~300 Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。
高速——流速为0.1~10.0 ml/min。
高效——可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。
高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。
HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：
速度快——通常分析一个样品在15~30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。
分辨率高——可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。
灵敏度高——紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。
柱子可反复使用——用一根色谱柱可分离不同的化合物。
样品量少，容易回收——样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。

高效液相色谱技术（HPLC）系统构成1 HPLC系统使用记录
1. 仪器使用记录：
⑴ 各组件的牌号、型号、编号、购进日期、安装日期、保单。
⑵ 标准参考条件的标准色谱图（流动相、流速、压力、温度、检测器参数、样品量等）：
反相色谱： 流动相：甲醇/水（70:30 V/V）
           柱：C18
           流速：1.0 mL/min
           检测器：UV 254nm
           样品：尿嘧啶（测t0）、苯酚、苯乙酮、硝基苯、苯甲醚、甲苯。
        ⑶ 使用记录：日期、工作内容、开机时间、样品数、仪器状态、操作者。
⑷ 维修记录：日期、原因、修理人、结果。（可备专用维修记录本）。
⑸ 换柱：牌号、种类、尺寸、标准色谱图。
⑹ 换部件：日期、原因、型号、编号、标准色谱图、操作人。
2. 个人实验记录
⑴ 日期、天气、室温。
⑵ 实验目的。
⑶ 色谱系统：厂名、型号等。
⑷ 操作条件：流动相（配比、pH、过滤脱气情况）。
⑸ 样品：予处理方法、进样体积。
⑹ 分析结果：数据、资料、色谱图。
⑺ 现象记录。
⑻ 参考文献。
3. 色谱柱记录
⑴ 原始记录：启用日期、填料种类、牌号、编号、标准色谱图（流动相、流速、压力、N、t0、tR、RS、Tf）。
⑵ 使用记录：仪器、样品、操作人。
⑶ 贮存记录：润湿溶剂、加盖否。
⑷ 维修记录：日期、原因、措施（补柱头、反冲、换板）。
⑸ 柱寿命：N、色谱图、操作人。

2 贮液器和流动相脱气
1.贮液器：常用干净的无水甲醇试剂并作贮液器，并要加盖以防灰尘落入，但并盖与导管之间应有缝隙，若过紧会形成真空。贮液并内要放置烧结不锈钢过滤器，即沉子，孔径为10μm，其作用是：①防止灰尘进入泵缸。② 作为进液导管的重物，使导管能沉在并底。
2.脱气：正相色谱如非水性凝胶色谱的流动相不必脱气，反相色谱的流动相需要脱气。
⑴ He氦气脱气：10min可以除去80～90％溶入的气体，但价格昂贵。
⑵ 真空脱气：这是最常用的方法，可用真空抽滤流动相的方法代替。
⑶ 超声脱气：使用方便，但只能脱气30％。
⑷ 加热回流：最彻底的脱气方法，混合流动相不能用。
4. 注意：
⑴ 溶剂过滤：常用0.5μm膜过滤。HPLC级溶剂：无微粒，无紫外吸收，已用
0.2μm膜过滤。
⑵ 贮液并要不定期更换，要有2～3个备用并，定期用酸、水、溶剂清洗。
⑶ 沉子：用三个月后必须清洗或更换，若未用沉子，则必须用0.5μm膜过滤。
⑷ 使用混合流动相时：易产生气体，可在系统外予混合后脱气。
⑸ 流动相不畅的原因：管路阻塞、长了霉菌、管道空化、贮液并盖子太紧。解决的办法有：抬高贮液并或向并内加压；去掉沉子；用稀硝酸洗去管道内微生物（洗前必须洗净醇类）。

3 色谱柱
常用柱尺寸：长25cm，内径4.6mm
注意事项：
1. 加流路过滤器与保护柱（予柱）：通常用3cm短柱，内径2mm。
2. 避免高压冲击：进样伐快转；泵起动时要由小流量开始。
3. 分离条件的选择：
pH：硅胶基质：pH 2.5～7.0，聚合物填料：pH 1～13 。极端pH的流动相能溶解硅胶。
温度：高温下用小颗粒填料柱会引起塌陷，柱效N下降一半：3μm柱，＞40℃；5μm柱，＞70℃。
4. 柱的保存：通常灌注纯有机溶剂保存。若用水（如凝胶柱），则加10％叠氮化钠。
5. 净化样品：①不含微粒；②防止蛋白质沉淀在柱头；③防止组分在固定相上保留
过强。
措施：先过滤样品；先做予试验（样品加入流动相中变浑否？）；用予柱除去强保留组分。若用6M NaOH 溶解的样品进样50～10μL，硅胶柱就报废。
    6. 定期洗柱：甲醇、乙腈洗掉柱中强保留组分，正向或反向洗，不要流过检测器，若无效：则换不锈钢过滤片，并用同种填料加乙醇调成糊状，补平柱头，或挖去2～3mm脏填料，重新填平（填料也可以不同种）。
7. 延长柱寿命：修补柱头；换不锈钢过滤片；冲洗柱；倒向用（柱效要下降
40～60％）。

4 泵─往复式恒流柱塞泵
三大问题：
    1. 单向伐故障：红宝石球与伐座密封不严。
      原因：⑴ 污染：气泡、微粒。
              解决方法：用25mL 水、甲醇、异丙醇、二氯甲烷 依次冲洗。在稀硝酸中超声15min ，用HPLC水洗2～3次、甲醇洗2次。
            ⑵ 磨损：对调红宝石球，使面密封变为线密封。
    2. 密封圈故障：渗漏、垫圈碎片污染系统。表现：压力不稳、泵头漏液。通常三个月或不定期换密封圈。拆泵头：兰宝石杆要缩至最短。
    3. 气泡：用脱气后甲醇冲洗。
予防措施：
    1. 用高质量溶剂和水作流动相。
2. 流动相脱气。
3.每天结束时：先用水洗，再用甲醇洗。若用过缓冲液：必须先水洗30～60min
（1ml/ min），再甲醇洗30min，千万不可先用甲醇冲洗，否则无机盐沉淀堵了管路。
    4. 及时换密封圈，加油。
    5. 用10mL水、10mL甲醇洗泵头排水孔。
6. 防止柱塞杆磨损。换新圈仍漏，则是柱塞杆被盐划伤。

5 进样器
      分手动、自动两种，通常实验室用的是手动。
     六通进样伐：惰性聚合物转子与陶瓷定子之间构成密封面。
     内装式：针头插到伐体内的转子部位，平头，有直径0.5mm和0.7mm两种。完全装液法与部分装液法均可使用。
外装式：进样孔与伐有距离，部分样品留在进样管道，不被注入样品环管，因而最好使用完全装液法
注意：
1. 内装式平针头决不可过长，不可超出转子面，否则将损坏进样伐。进样后可不拔出针头，进样量不限。外装式进样量要过量，进柱样品量精确度比内装式高。
    2. 转手柄要快：＜1秒，不允许仃在中间！
3. 用后要立即清洗：
  使用了强腐蚀性溶剂：用水和有机溶剂清洗。
使用了含盐缓冲液：用后立即用水洗净进样孔和导管，否则会损坏密封面。
4. 针头不可过细，否则针头密封圈失效而渗漏。

6 检测器
    检测器的作用是将浓度的变化变成电信号。
1. 紫外检测器：
195～350nm 的可变波长检测器通常使用氘灯。1024个二极管的二极管阵列检测器可作吸光度、时间和波长的三维检测，画出三维立体山峰形状的图形。
      石英流动池为“Z”形，约8μl，光池为1mm×10mm。
注意问题：
⑴ 氘灯寿命只有 400～1000小时，要注意节灯。
⑵ 气泡：谱图上出现许多毛刺峰，是光池内有气泡，可用脱气后的甲醇或异丙醇冲洗。
⑶ 污染与堵塞：反向冲洗顺序为：50ml无水乙醇→50ml水→250ml 3M硫酸→100ml水。为防止酸喷出，可用反向负压回抽法（用注射器）。
⑷ 正确选择检测波长：通常用该样品紫外扫描吸收光谱的波峰波长。
2. 荧光检测器：将溶质样品衍生为荧光物质，检测灵敏度比紫外高10～1000倍。
3. 示差折光检测器：灵敏度较低，用于糖类样品的检测。
高效液相色谱仪的简易操作按照下面各步骤逐步操作：
一、打开检测器、系统控制器、计算机、采集器的电源
   检测器、系统控制器需要有一个预热过程（要等待30分钟左右）

二、样品分析方案的建立
    双击电脑屏幕上的“HS2000色谱工作站”——在窗口上方的菜单栏中点击“样品”——“新样品”——A通道，会发现软件窗口左上角出现“样品”，左键点击“样品”，按提示填写所需内容。
    a. 若需知道样品中各组分的百分比，选择“归一法”直接点击“完成”，方案即建立，等待高效液相进样后采集数据；
    b. 若需知道样品中各组分的含量，选择“外标法”，需先建立校正曲线，点击“完成”后，等待高效液相进样后采集数据。数据采集结束后，点击“采样结束”——确认——选定目标峰——赋予组分名——查看校正曲线；在“确认”窗口中，选择“检测样品”，再“确认”，即可检测未知样品的已知组分的含量。

三、检测器的设定
   在检测器控制器面板上，按上下方向键选择波长和灵敏度，输入需要的数值，按“Enter”键确认。

四、系统控制的设定
   等度分析：按“direct”设定A、B、C、D流动相的百分比，直接输入“flow rate”(0.8-1.5ml/min)，按Enter 即可。
   梯度分析：按“program method”, 编辑梯度洗脱的程序，按“save”，保存到“program table”(1-15)中，按“operate method”, 输入你在“program table”中所保留的数字(1-15)，再按“operate method”即可。

五、色谱泵和色谱柱的清洗
   色谱泵和色谱柱的清洗要用梯度清洗，保证色谱泵和色谱柱内无污染物。

六、排气和进样
   排气：若发现流动相输液管中有气泡或压力不稳定，将抽液阀调至“ draw”处，用注射器抽液直至气泡消失，之后将此阀调至“run”位。如长久不用，打开参考阀，排液10分钟。高液相开机后，一般都需要排液和抽液，以清除进液管道及泵中的空气。
进样： 用制备色谱(Semi-Prep)和分析色谱(Analytical)的控制阀，即高液相右下角的一个黑色旋钮，选择所需分析类型。如选择了分析型(Analytical)色谱分析，将分析旋钮调至“Load”位，用注射器注射一定量的溶剂，再将旋钮调至“Inject”位。此时，即可观察色谱分析的采集图谱。 

七、重复步骤五的操作，防止色谱泵和色谱柱的污染 
操作结束后详细填写设备使用记录
注意事项：
1、制备样品的浓度有经验值，在这个范围内检测灵敏度比较高。
2、使用前和使用后的两次色谱泵和色谱柱的清洗，一定要按照规定完成，决不能偷工减料。
3、进样针头的清洗，把抽屉里的白色塑料接头，接在注射器上，用100%甲醇象“进样”一样操作2-3次，以此来清洗进样器。

高效液相色谱仪操作步骤    1)． 过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。
    2)． 对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。
    3)． 打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。
    4)． 进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。
    5)． 有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用
   针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10ml/min。
    6)． 调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。
    7)． 设计走样方法。点击file，选取select users and methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击new method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。
    8)． 进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。
    9)． 关机时，先关计算机，再关液相色谱。
 注意事项：
    1)． 流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。
    2)． 柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。
    3)． 所有过柱子的液体均需严格的过滤。
    4)． 压力不能太大，最好不要超过2000 psi。

高效液相色谱常见故障的断定及解决     (一)保留时间变化
         1.柱温变化 柱恒温，必要时需配置恒温箱
         2.等度与梯度间未能充分平衡 至少用10倍柱体积的流动相平衡柱
         3.缓冲液容量不够 用》25mmol/L的缓冲液
         4.柱污染 每天冲洗柱
         5.柱内条件变化 稳定进样条件,调节流动相
         6.柱快达到寿命 采用保护柱
     (二)保留时间缩短
        1.流速增加 检查泵,重新设定流速
        2.样品超载 降低样品量
        3.键合相流失 流动相PH值保持在3~7.5检查柱的方向
        4.流动相组成变化 防止流动相蒸发或沉淀
        5.温度增加 柱恒温
      (三)保留时间延长
        1.流速下降 管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡
        2.硅胶柱上活性点变化 用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱
        3.键合相流失 同前(二)3
        4.流动相组成变化 同前(二)4
       5.温度降低 同前(二)5
     (四) 出现肩峰或分*
        1.样品体积过大 用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%
        2.样品溶剂过强 采用较弱的样品溶剂
        3.柱塌陷或形成短路通道 更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件
        4.柱内烧结不锈钢失效 更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品
        5.进样器损坏 更换进样器转子
     (五)鬼峰
        1.进样阀残余峰 每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗
        2.样品中未知物 处理样品
        3.柱未平衡 重新平衡柱,用流动相作样品溶剂 (尤其是离子对色谱)
        4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱) 每天新配,用抗氧化剂
        5.水污染(反相) 通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水
     (六) 基线噪声
        1.气泡(尖锐峰) 流动相脱气,加柱后背压
        2.污染(随机噪声) 清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂
        3.检测器灯连续噪声 更换氘灯
        4.电干扰(偶然噪声) 采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)
        5.检测器中有气泡 流动相脱气,加柱后背压
     (七)峰拖尾
        1.柱超载 降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相
        2.峰干扰 清洁样品,调整流动相
        3.硅羟基作用 加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品
        4.同前(四)4 同前(四)4
        5.同前(四)3 5.同前(四)3
        6.死体积或柱外体积过大 连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管
        7.柱效下降 用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱
      (八)峰展宽
        1.进样体积过大 同(四)1
        2.在进样阀中造成峰扩展 进样前后排出气泡以降低扩散
        3.数据系统采样速率太慢 设定速率应是每峰大于10点
        4.检测器时间常数过大 设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%
        5.流动相粘度过高 增加柱温,采用低粘度流动相
        6.检测池体积过大 用小体积池,卸下热交换器
        7.保留时间过长 等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱
        8.柱外体积过大 将连接管径和连接管长度降至最小
        9.样品过载 进小浓度小体积样品
高效液相色谱仪系统使用的常见问题及解决方法1 高效液相色谱仪系统
液相色谱仪主要由贮液瓶、泵、进样器、柱子、柱温箱、检测器、数据处理系统组成。对于整个系统而言，柱子、泵和检测器是核心部件同时也是易出问题的主要部位。
2 常见问题及解决方法
高效液相作为一种高精密仪器，如果在使用过程中不按照正确操作的话，就容易导致一些问题。其中最常见的就是柱压问题、漂移问题、峰型异常问题。
2.1 柱压问题 柱压问题是使用高效液相色谱过程中需要密切注意的地方，柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效、分离效果及保留时间等密切相关。所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值而是指压力波动范围在50PSI之间（在使用梯度洗脱时，柱压平稳缓慢的变化是允许的）。压力过高、过低都属于柱压问题。
2.1.1 压力过高 这是高效液相在使用中最常见的问题，指的是压力突然升高，一般都是由于流路中有堵塞的原因。此时，我们应该分段进行检查。
(1).首先断开真空泵的入口处，此时PEEK管里充满液体，使PEEK管低于溶剂瓶，看液体是否自由滴下，如果液体不滴或缓慢滴下，则是溶剂过滤头堵塞。处理方法：用30%的硝酸浸泡半个小时，在用超纯水冲洗干净。如果液体自由滴下，溶剂过滤头正常，在检查；
(2).打开Purge阀，使流动相不经过柱子，如果压力没有明显下降，则是过滤白头堵塞。处理方法：将过滤白头取出，用10%的异丙醇超声半个小时。如果压力降至100PSI以下，过滤白头正常，在检查；
(3).把色谱柱出口端取下，如果压力不下降，则是柱子堵塞。处理方法：如果是缓冲盐堵塞，则用95%的水冲至压力正常。如果是一些强保留的物质导致堵塞，则要用比现在流动相更强的流动相冲至压力正常。假如按上面的方法长时间冲洗压力都不下降，则可考虑将柱子的进出口反过来接在仪器上，用流动相冲洗柱子。这时，如果柱压仍不下降，只有换柱子入口筛板，但一旦操作不甚，很容易造成柱效下降，所以尽量少用。 
2.1.1 压力过低 压力过低的现象一般是由于系统泄漏，处理方法：寻找各个接口处，特别是色谱柱两端的接口，把泄漏的地方旋紧即可。当然还有一个原因就是泵里进了空气，但此时表现的往往是压力不稳，忽高忽低，更严重一点会导致泵无法吸上液体。处理方法：打开Purge阀，用3~5ml/min的流速冲洗，如果不行，则要用专用针筒在排空阀处借住外力将气泡吸出。
2.2．漂移问题 主要包括基线漂移和保留时间漂移。
2.2.1基线漂移     一般说来，机器刚起动时，基线容易漂移，大概要半个小时的平衡时间，如果你用了缓冲溶液或缓冲盐，还有就是在低波长下（220nm）平衡时间相对会比较长，但如果你在实验过程中发现基线漂移，则你要考虑下面的原因：
1、柱温波动。解决方法：控制好柱子和流动相的温度，检查是否有打开的窗户或空调对着柱温箱。 
2、流通池被污染或有气体。 解决方法：用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池（最好断开柱子）。如有需要，可以用1N的硝酸（不要用盐酸）。
3、紫外灯能量不足。解决方法：更换新的紫外灯
4、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成。解决方法：检查流动相的组成，使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂。
5、样品中有强保留的物质（高K’值）以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线。解决方法：使用保护柱，如有必要，在进样之间。在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子。
6、检测器没有设定在最大吸收波长处。解决方法：将波长调整至最大吸收波长处
7、流动相的PH值没有调节好。解决方法：加适量的酸或碱调至最佳PH值
2.2.2保留时间漂移     保留时间重现是液相性能好坏的一个重要标志，同一种东西，两次的保留时间相差不要超过15s，超过了半分钟可看做保留时间漂移，就无法进行定性，你要考虑以下原因：
1、温控不当。解决方法：调好柱温，检查是否有打开的窗户或空调对着柱温箱。
2、流动相比例变化。解决方法：检查四元泵的比例阀是否有故障
3、色谱柱没有平衡。解决方法：在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱
4、流速变化。解决方法：重新设定流速
5、泵中有气泡。解决方法：、从泵中除去气泡
2.3 峰型异常问题 峰型问题是液相的主要问题，在做液相过程中，我们就是要变换不同的条件来改善不好的峰型，对于各种各样的异常峰，要区别对待，从主要问题出发，一个一个加以解决。 
1、色谱图中未出峰。解决方法：系统未进样或样品分解；泵未输液或流动相使用不正确；检测器设置不正确；针对以上情况成因作相应调整即可。
2、 一个峰或几个峰是负峰。解决方法：流动相吸收本底高；进样过程中进入空气；样品组分的吸收低于流动相。
3、 所有峰均为负峰。解决方法：信号电缆接反或检测器输出极性设置颠倒；光学装置尚未达到平衡。
4、所有峰均为宽峰。解决方法：系统未达到平衡；溶解样品的溶剂极性比流动相差很多；色谱柱尺寸及类型选择不正确；色谱柱或保护柱被污染或柱效降低；温度变化造成的影响。 、
5、所出峰比预想的小。解决方法：样品黏度过大；进样品故障或进样体积误差；检测器设置不正确．定量环体积不正确；检测池污染；检测器灯出现问题。
6、出现双峰或肩峰。解决方法：进样量过大；样品浓度过高；保护柱或色谱柱柱头堵塞；保护拄或色谱柱污染或失效；柱塌陷或形成短通道。
7、前伸峰。解决方法：进样量或样品浓度高；溶解样品的溶剂较流动相极性强；保护柱或色谱柱污染或失效。
8、拖尾峰。解决方法：柱超载，降低样品量；增加柱直径采用较高容量的固定相；峰干扰，对样品进行清洁过滤；调整流动相；硅羟基作用，加入三乙胺，用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相pH值；柱内烧结不锈钢失效，更换烧结不锈钢；加在线过滤器，对样品进行过滤；死体积或柱外体积过大，将连接点降至最低；尽可能使用内径较细的连接管；柱效下降，更换柱子；采用保护柱，对柱子进行再生。
9、出现平头峰。解决方法：检测器设置不正确；进样体积太大或样品浓度太高。
10、出现鬼峰。解决方法：进样阀残余峰，在每次进完样后用充足的时间来平衡和清洗系统；样品中存在未知物，改进样品的预处理；流动相污染，更换新流动相，尽可能现配现用，隔夜的流动相再次使用时要过滤；尽可能使用HPLC级试剂；流路中有小的气泡，打开Purge阀，加大流速排除。
HPLC的正确使用和科学保养    1、保持贮液瓶清洁，对专用贮液瓶应定期清洗；用试剂瓶作贮液瓶时，要经常更换。
    2、定期（如半个月）在稀硝酸溶液中超声、清洗过滤器，保持过滤器畅通无阻。
    3、使用HPLC试剂和新蒸二次蒸馏水作流动相，所使用的溶剂其截止波长一定要低于检测波长，对不是HPLC级的试剂要进行过滤（HPLC试剂出厂前已用0.02μm滤膜过滤）。对流动相一定要脱气。
    4、每天开始使用仪器，注意放空排气，确保泵头、流动池以及其它流路系统中无气泡存在。
    5、珍惜保护色谱柱，避免柱头突然产生大的波动，扰动损伤柱床。如避免泵启动过速、升压过快、样品阀搬动过慢所造成的柱压大的波动。
    6、采用保护（警戒）柱，延长柱寿命。如污染物堆积于保护柱柱头，造成柱压升高，柱效下降，峰形变差时，卸下用强溶剂反冲后再用或更换新保护柱。
    7、避免超负荷进样，对250×4.6mm的柱子,绝对进样量应不超过100μg。在灵敏度允许的前提下，应尽量将试样浓度降低，减少绝对进样量（进样体积可保持不变），这是保持HPLC柱性能持久良好的重要举措之一。
    8、经常用强溶剂冲洗柱子，将柱内强保留组分及时洗脱出。反相柱用异丙醇--二氯甲烷（1：1）冲洗，正相（硅胶柱）用纯甲醇或异丙醇冲洗，时间均不少于1h。
    9、做完试验，及时用适当溶剂冲洗柱子和进样阀，尤其是对过夜的柱子和进样阀，一定要用足量的水彻底洗净其中的盐类、缓冲液，再用甲醇或乙腈冲洗，并保存在乙腈中。正相柱保存在非极性有机溶剂（如己烷）中。
    10、以硅胶为基质的柱子，如C-18、C-8等，要控制好流动相的pH值，一般不要低于2.5，不高于7.0。
    11、尽量用流动相溶解样品，一是避免出现拖尾峰、怪峰，二是避免试样在系统中由于溶解度降低而析出。
    12、对于阻塞或受伤严重的柱子，必要时，可卸下不锈钢滤板，超声洗去滤板阻塞物，对塌陷污染的柱床进行清除、填充、修补工作，此举可使柱效恢复到一定程度（80%），有继续使用的价值。
    13、色谱仪检测器输出与积分仪（处理机）要匹配，要合理设置参数如斜率、半峰宽、阈值、AUFS值、衰减等。将适宜的进样量和合适的参数结合起来，使主峰峰高达到记录仪满量程的80%左右。
    14、用HPLC分析酸碱性物质，由于吸附作用（次级保留）使峰开拖尾。加入改良剂可以大大改善峰形，提高积分的准确度。一般规则是：（1）分析酸性物质，可加入1%有醋酸。（2）分析碱性物质，可加入10-20mmol/L三乙胺。（3）酸碱物质混为一体，可同时加入1%的醋酸和10-20mmol/L三乙胺
高效液相色谱仪的使用与维护1.流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)。
2.流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。
3.不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。
4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时，然 后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40分钟以上，以充分洗去离子。对于柱塞杆 外部，做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml以上。
5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。
6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。
7.C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。
8.堵塞导致压力太大，按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查 并清洗。清洗方法；①以异丙醇作溶剂冲洗：②放在异丙醇中间用超声波清 洗；③用10％稀硝酸清洗。
9.气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。
10.如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相 的清洗。
11.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。
12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的 流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。
高效液相色谱仪常见故障处理（以C - 10AT为例）故障1    流动相内有气泡, 关闭泵, 打开泄压阀, 打开p urge键, 清洗脱气, 气泡不断从过滤器冒出, 进入流动相, 无论打开p urge 键几次,都无法清除不断产生的气泡。
    原因过滤器长期沉浸于乙酸铵等缓冲液内, 过滤器内部由于霉菌的生长繁殖,形成菌团,阻塞了过滤器,缓冲液难以流畅地通过过滤器,空气在泵的压力作用下经过滤器进入流动相。
    处理过滤器浸泡于5 %硝酸溶液中,超声清洗几分钟即可;亦可将过滤器浸泡于5 %硝酸溶液中12～36 小时, 轻轻震荡几次, 再将过滤器用纯水清洗几次, 打开泄压阀, 打开p urge 键,清洗脱气, 如仍有气泡不断从过滤器冒出, 继续将过滤器浸泡于5 %硝酸溶液中,如没有气泡不断从过滤器中冒出,说明过滤器内部的霉菌菌团已被硝酸破坏, 流动相可以流畅地通过过滤器。打开泄压阀,打开泵,流速调至1. 0～3. 0ml/ min ,纯水冲洗过滤器1 小时左右。即可将过滤器清洗干净。关闭泄压阀,纯甲醇冲洗半小时即可。
故障2    柱压高原因(1) 缓冲液盐分如(乙酸铵等) 沉积于柱内; (2) 样品污染沉积。
    处理对于第一种情况先用40～50 ℃的纯水,低速正向冲洗柱子, 待柱压逐渐下降后, 相应提高流速冲洗, 柱压大幅度下降后, 用常温纯水冲洗, 之后用纯甲醇冲洗柱子30 分钟; 对于第二种情况,由样品的沉积引起污染的C18柱,和纯水反向冲洗柱子, 然后换成甲醇冲洗, 接着用甲醇+ 异丙醇(4 + 6) 冲洗柱子(冲洗时间的长短由样品污染的情况而定) , 再用换成甲醇冲洗, 然后用纯水冲洗, 最后甲醇冲洗正向冲洗柱子30 分钟以上。
故障3    既无压力指示,又无液体流过[1 >。
    原因(1) 泵密封垫圈磨损; (2) 大量气泡进入泵体。
    处理对于第一种情况,更换密封垫圈;对于第二种情况,在泵作用的同时, 用一个50ml 的玻璃针筒在泵的出口处帮助抽出空气。
故障4    压力波动大,流量不稳定. 
    原因系统中有空气或者单向阀的宝石球和阀座之间夹有异物,使得两者不能密封。
    处理工作中注意观察流动相的量, 保证不锈钢滤器沉入储液器瓶底,避免吸入空气,流动相要充分脱气[2 >。如为单向阀和阀座之间夹有异物, 拆下单向阀, 放入盛有丙酮的烧杯用超声波清洗.
故障5    出峰不佳,峰分叉。
    原因(1) 色谱柱被污染; (2) 柱头填料塌陷。
    处理对于第一种情况, 先用纯水反向冲洗柱子, 然后换成甲醇冲洗, 接着用甲醇+ 异丙醇(4 + 6) 冲洗柱子(冲洗时间的长短由样品污染的情况而定) , 再换成甲醇冲洗, 然后用纯水冲洗,最后甲醇冲洗正向冲洗柱子30 分钟以上。如冲洗后依然出峰不佳,则考虑第二种情况。对于第二种情况,拧开柱头,检查柱填料是否硬结或塌陷。去除硬结部分(污染的填料) ,装入新填料, 滴一滴甲醇, 填料下陷, 再填, 用与柱内径相同的顶端平滑的不锈钢杆压紧, 再填平, 滴甲醇, 再压紧反复几次, 直至装满填平[2 >。柱头用甲醇冲洗干净, 擦净柱外壁的填料, 拧紧柱头,用纯甲醇冲洗30 分钟以上。
故障6    峰面积重复性不佳。
    原因(1) 进样阀漏液; (2) 加样针不到位。
    处理对于第一种情况更换进样阀垫圈; 对于第二种情况保证加样针插到底,注射样品溶液后须快速、平稳地从LOAD 状态转换到INJ EC T 状态,以保证进样量的准确。日常工作中, 液相色谱仪的保养非常重要, 如要注意不要让空气进入输液系统和高压泵中, 储液器内的溶液如长时间未用应清洗储液器并更换溶液, 每次用完色谱仪后缓冲液要用纯水冲洗干净,防止无机盐析出或沉积; 样品的前处理也很重要,任何样品都要尽可能地去除杂质, 完全溶解, 尽量减少对色谱柱的污染, 以延长色谱柱的使用寿命, 同时避免注射过浓的样品溶液, 以免残留液在进样阀内析出固体引起堵塞; 色谱柱作好标记,用于不同分析目的的色谱柱不要混用等。
HPLC应用举例HPLC法在生物碱分析中的应用生物碱是植物中一类重要化学成分，许多生物碱或含生物碱的提取物已广泛用于医药领域，因此对不同来源的、存在于较复杂体系或基质中的生物碱进行快速、灵敏、可靠的定性和定量分析一直是受人瞩目的研究课题。
1、生物碱HPLC的分析模式
    根据HPLC分析生物碱时所使用固定相性质、流动相组成及极性不同，其分析模式大致可分为：正相吸附色谱法、正相硅胶反相洗脱系统色谱法、反相色谱法及离子交换色谱法。
    正相吸附色谱法：通常以硅胶基质为吸附固定相，流动相为不同极性的有机溶剂或不同比例混合溶剂，分离过程主要依靠生物碱与吸附剂吸附作用的差异实现，为了改善分离，提高溶洗脱能力，常于流动相中加浓氨液、二乙胺、三乙胺等。该法应用于生物碱分析的文献较少。
    正相硅胶一反相洗脱系统色谱法(NS-RE)：通常采用未经化学改性的普通硅胶为固定相，以极性有机溶剂(甲醇、乙腈)和高pH缓冲溶液为流动相，分析包括生物碱在内的碱性药物。该法柱效高，峰形对称，是简便有效的方法。在实际应用中，流动相的组成是主要的影响因素，流动相中除含有调节pH 的缓冲盐外，有时还要三乙胺、溴化四丁基铵等竞争离子或烷基磺酸钠等对离子。因此，影响保留与分离的主要因素是流动相pH、竞争离子种类及浓度 。
    反相高效液相色谱 法(RP-HPLC)：近年来RP-HPLC应用于生物碱分析方面的文献很多，已成为常规的方法。但普通存在色谱峰的展宽拖尾，导致分离效能低，这主要缘于生物碱结构中碱性氮原子与固定相未键台酸性硅醇基的相互作用。即使是所测生物碱在较低浓度下，仍常产生峰漂移及峰对称性差等现象。针对此缺陷，研究工作者从适用于碱性物质分析的反相填料的设计选择，流动相中缓冲盐的使用，流动相添加剂(离子对试剂、有机胺改性剂)等几方面进行了较为广泛细致的研究，并取得了一定的进展。
    离子交换色谱法：该法以阳离子交换树脂为固定相，利用质子化的生物碱阳离子与离子交换剂交换能力的差异而达到分离生物碱的目的，有关生物碱高效液相离子交换色谱法的应用报道较少。
2、生物碱HPLC分析检测方法
    目前，生物碱HPLC分析检测方式多以紫外法为主，在定性分析方面，紫外法检测选择性低，定性专属性差。随着二极管阵列检测器使用的普及，显著提高了液相分析检测的选择性。此外，根据生物碱的理化性质，其它检测方式如荧光法、电化学法、蒸发光散射法亦得到了应用。近年来，液相色谱 -质谱联用技术已应用于生物碱分析，增强了对生物碱的定性检测能力，提高了检测灵敏度。新的接口技术及离子化方法的发展．使得HPLC-MS在生物碱的分析中得到较广泛的应用，近年的文献报道日渐增多。
3、生物碱HPLC分析的样品处理方法
    因生物碱常具有一定的碱性，一般常用碱化液液萃取或酸水提取等方法从中草药、中成药及生物样品等较复杂体系中提取纯化，以达到富集和去除杂质的目的。近年来，固相萃取(SPE)技术及超临界流体萃取等现代提取纯化技术亦应用于样品的提取纯化。

HPLC法鉴别五味子与南五味子五味子为木兰科植物五味子Schisandra Chinensis(Turcz)Bail1．的干燥成熟果实，习称“北五味子”，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的功效 。南五味子为木兰科植物华东五味子
Schisandra sphenanthe Rehd．et Wills．的干燥成熟果实，功效与五味子相似。中药成方制剂中都明确指定用何种五味子，且《中国药典)2000年版分别单独制定了质量标准。市场上这两种五味子价格相差较大，因此鉴别很重要。《中国药典)2000年版收载的标准中有薄层色谱鉴别，都采用了五味子甲素作为对照品，再分别用各自的对照药材作对照。采用HPLC法进行鉴别，重复性好、灵敏度高且直接分析的是其特征峰，鉴别结果不受环境等因素干扰，为五味子的鉴别提供了可靠的手段。
1 仪器和试药
1．1 仪器：高效 液相色谱 仪(泵：SP1000，检测器UV2000，N2000工作站，美国光谱物理公司)。
1．2 试药：五味子对照药材(批号：0922—9803中国药品生物制品检定所)；五味子(毫州恒丰药材公司)；南五味子(毫州恒丰药材公司)。色谱纯甲醇；超纯水。
2 方法与结果
2．1 对照药材溶液的制备：取五味子对照药材粉末约0．25 g，置25 mL量瓶中，加甲醇约18 mL，超声处理(功率250 W ，频率20 kHz)30分钟，取出，放冷至室温，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，即得。
2．2 色谱条件：色谱柱：AllitimaC18(4．6 mm×250 mm)。流动相：甲醇．水(13：7)。检测波长：250 nm。流速：0．8mL／min。柱温：25℃ 。
2．3 供试品溶液的制备
2．3．1 五味子药材提取液的制备：取五味子药材粉末(过3号筛)约0．25 g，置25 mL量瓶中，加甲醇约18 mL，超声处理30分钟，放冷至室温，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，即得。
2．3．2 南五味子药材提取液的制备：取南五味子药材粉末(过3号筛)约0．25 g，置25 mL量瓶中，加甲醇约18 mL，超声处理30分钟，放冷至室温，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，即得。
2．4 图谱的绘制：分别精密吸取对照药材溶液与供试品溶液各20 L，注入液相色谱 仪，测定。 发现五味子对照药材共9个峰，样品五味子共8个峰，南五味子共6个峰，样品五味子与对照药材相比少1个峰，其它峰保留时间都一致，南五味子少了3个峰，且只有1个峰相一致，由此，可以鉴定出五味子。经过多次实验结果，对照药材1、2、6、7、8号峰是五味子的主要特征峰，且峰面积较大。
HPLC双波长法测定葛根芩连微丸中葛根素、黄芩苷的含量葛根芩连微丸具有解肌清热、止泄止痢之功效。用于治疗泄泻痢疾，身热烦渴、下痢臭秽、菌痢、肠炎等症。2000年版药典以测定其中盐酸小檗碱的含量来控制其质量。本文采用HPLC双波长法同时检测其中葛根素和黄芩苷的含量，操作简便，方法可靠，重现性好，可以作为本产品质量控制的方法。
    1 仪器、药品与试剂
    仪器：Waters515型高效液相色谱 仪，2487型双波长紫外检测器，717自动进样器，Millennium32色谱管理系统，Sartorius BP211D型电子天平。
    对照品：葛根素(0736-9913)、黄芩苷(1 10715-200212)对照品均由中国药品生物制品检定所提供。
    药品：葛根芩连微丸(批号：20020509、20020511、20020515)广西某制约厂。
    试剂：甲醇为HPLC级，磷酸为分析纯，水为亚沸蒸馏水(自制)。
    2 实验方法与结果
    2．1 色谱条件分析
    色谱柱：Kromasil Cl8柱(4.6 inln×250 mm，5μm)，以甲醇-0.2％磷酸为流动相，梯度洗脱。检测波长λ1=250 nm(检葛根素)，λ2=315 nm(检黄芩苷)，柱温30℃，流速1.0mL/min。
2．2 系统适应性试验
    按样品含量测定项下方法制备供试品溶液，取该供试品溶液l0μL，注入高效液相色谱 仪测试，葛根素和黄芩苷的保留时间分别为6.0min和23.7min。理论塔板数以葛根素计不低于3000，葛根素色谱峰与相邻未知色谱峰的分离度不低于1.5，黄芩苷色谱峰与相邻未知色谱峰的分离度不低于1.6。
2．3 标准曲线的制备
    分别精密称取干燥至恒重的葛根素、黄芩苷对照品适量，配制成浓度分别为160μg/mL、263 μg/mL 的对照品储备液I、Ⅱ。分别精密吸取上述储备液10.2，0.6，1.0，1.4，1.8mL，储备液I10.2，0.5，0.8，1.1，1.4，1.7mL置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制得标准溶液系列，取10μL进样，测定。以对照品浓度对峰面积平均值作图，结果经回归分析，葛根素在32.0～288.0ng范围内有良好的线性关系，回归方程为Y=44793X+1030，r：0.9998；黄芩苷在52.6～447.1ng范围内有良好的线性关系，回归方程为Y=21793X一1050，r=0.9999。
    2．4 空白干扰试验
    按处方制备不含葛根、黄芩药材的样品，依供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。取阴性样品溶液、样品溶液和对照品溶液在上述色谱条件下各进样10μL，得HPLC图谱。可知，阴性样品溶液对样品溶液含量测定无干扰。
    2．5 精密度试验
    分别精密吸取对照品储备液I、Ⅱ各1.0，0.8 mL于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制得混合标样，取10μL进样，重复6次，以峰面积计算RSD，葛根素RSD=0.80％，黄芩苷RSD=1.46％ 。
    2．6 重复性试验
    取同一批样品(批号20020509)6份，分别制成供试品溶液，按含量测定法测定，结果葛根素平均含量为1.75mg/g，RSD=1.55％，黄芩苷平均含量为2.27mg/g，RSD=1.92％。
    2．7 稳定性试验
    精密吸取新配制的供试品溶液(批号20020509)，按样品含量测定法每隔2h取lOμL进样测定，结果葛根RSD=1．06％，黄芩苷RSD=1.15％。表明样品溶液在12h内保持稳定。
    2．8 加样回收率试验
    分别精密称取干燥至恒重的葛根素、黄芩苷对照品适量，配制成葛根素、黄芩苷浓度分别为176，226 μg/mL 的混合对照品溶液，作为标准加样储备液。精密称取葛根芩连微丸(批号20020509)0.05g，平行9份，分别加入上述标准加样储备液0.4，0.5，0.6 mL，再精密加入甲醇9.6，9.5，9.4 mL，每个平行3份，按供试品溶液制备方法制成加样回收样品液。取lOμL进样，以10mL中的绝对量计算加样回收率。
    2．9 样品含量测定
    分别精密称取3个批号的葛根芩连微丸各0.1g置于25mL锥形瓶中，精密吸取10mL甲醇加入该锥形瓶，精密称定，超声30min，放置至室温，精密称定，用甲醇补足损失的重量，摇匀，离心(12000r/min )3 min，将上清液过微孔滤膜，取续滤液10μL进样，以标准曲线计算含量，每个批号平行3份，每份进样2次。
    3．1 流动相的选择
    本实验比较了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸-水、乙腈-磷酸-水、甲醇-醋酸-水、乙腈-醋酸．水系统及梯度洗脱条件下对样品中葛根素、黄芩苷分离度的影响，结果发现采用甲醇-0.2％磷酸梯度洗脱时葛根素、黄芩苷即能得到良好的分离。
    3．2 提取方法的比较
    本实验采用了索氏提取、水浴回流、超声提取等方法来提取葛根芩连微丸中的葛根素、黄芩苷，结果发现一次超声30min，即能将二者提取完全。
RP-HPLC测定连翘病毒清胶囊中连翘酯苷和连翘苷的含量    1 仪器与试药
    Waters515高效液相色谱 仪；METTLER-AE240型电子分析天平(日本岛津)；CX-250型  超声波清洗 机(北京医疗设备二厂)；YWC-Cl8色谱柱(北京分析仪器厂制造)；乙腈为色谱纯；水为重蒸水；冰醋酸为分析纯。连翘苷对照品(批号0821-96O2)，购自中国药品生物制品检定所，连翘酯苷对照品自制，经紫外、红外、质谱、核磁共振及元
素分析确认结构，HPLC归一化法测定含量为98％以上。连翘购自北京同仁堂集团北城药材批发部，经北京中医药大学生药系刘春生副教授鉴定为木犀科植物连翘Forsythia suspensa(Tnunb．)Vah1．的干燥果实。
    2 方法与结果
    2．1 色谱条件
    2．1．1 连翘苷YWC-Cl8色谱柱(4.6mmX 250mm，10μm)，流动相乙腈-水(25：75)，流速0.8 mL/min，检测波长277nm，柱温为室温，理论塔板数以连翘苷峰计应不低于3500。
    2．1．2 连翘酯苷YWG—Cl8色谱柱(4.6mm×250mm，10μm)，流动相乙腈-水-冰醋酸(17：3：0.4)，流速1.0 mL/min，检测波长280nm，柱温为室温，理论塔板数以连翘酯苷峰计应不低于8000。
上述色谱条件下，连翘病毒清胶囊中连翘苷和连翘酯苷色谱峰分别与其他成分分离良好。
    2．2 对照品溶液的制备
    精密称取连翘苷和连翘酯苷对照品适量，分别加甲醇制成0.0820，0.0505g/L的对照品溶液。
    2．3 样品溶液的制备
    取连翘病毒清胶囊内容物各约25，10 mg，精密称定，分别加50％乙醇适量，超声波处理使之溶解后，定容至10 mL量瓶中，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，作为测定连翘苷的样品溶液I和测定连翘酯苷的样品溶液Ⅱ。
    2．4 线性关系的考察
    分别精密吸取连翘苷对照品溶液2.5，5.0，10.0，15.0，20.0μL和连翘酯苷对照品溶液3.0，5.0，10.0，15.0，20.0μL，按上述连翘苷和连翘酯苷色谱条件，测定峰面积。以色谱峰峰面积为纵坐标，对照品进样量为横坐标，绘制标准曲线并进行线性回归，计算回归方程。连翘苷：Y=806271X一1157.2，r=0.9998，线性范围0.21～1.6μg；连翘酯苷：Y=245399 +63339，r=0.9996，线性范围0.15～1.0μg。
    2．5 精密度试验
    精密吸取样品溶液I20.0μL和样品溶液Ⅱ5.0μL，分别连续进样5次，测得连翘苷色谱峰峰面积平均值为1013 553，RSD 0.78％，连翘酯苷色谱峰峰面积平均值为237 466，RSD 1.1％。
    2．6 稳定性试验
    精密吸取样品溶液I20.0μL和样品溶液Ⅱ5.0μL，分别在制备后0，4，8，12，24h和0，2，4，8，12，24h进样，测定连翘苷和连翘酯苷色谱峰峰面积，计算峰面积相对标准偏差RSD分别为1.7％和2.1％。表明样品溶液I和样品溶液Ⅱ在24h内稳定性均良好。
    2．7 回收率试验
    2．7．1 连翘苷回收率试验 精密称取已知含量(1.41％)的连翘病毒清胶囊内容物5份，每份约15.0mg，置10 mL量瓶中，分别精密加入含量为0.0820g/L连翘苷对照品溶液2.5mL，照样品溶液制备项下方法处理，按样品测定项下方法测定，计算平均回收率为99.6％，RSD 1.9％。
    2．7．2 连翘酯苷回收率试验精密称取已知含量(11.20％)的连翘病毒清胶囊内容物5份，每份约5.0 mg，置10mL量瓶中，分别精密加入含量为0.050 5g/L 连翘酯苷对照品溶液10.0 mL，照样品溶液制备项处理，按样品测定项测定，计算平均回收率为101.3％，RSD 2.5％。
    2．8 重复性试验
    分别取同一批连翘病毒清胶囊，按样品测定项下方法，各连续测定5次，得连翘苷平均含量为1.41％，RSD 1.4％(n=5)；连翘酯苷平均含量为11.2％，RSD 2.9％(n=5)。
    2．9 样品测定
    分别精密称取3批连翘病毒清胶囊内容物，按样品溶液的制备项下方法分别制备样品溶液；精密吸取样品溶液I 20.0μL，样品溶液Ⅱ5.0μL，连翘苷对照品溶液8.0，10.0μL，连翘酯苷对照品溶液5.0，10.0μL，注入液相色谱 仪，依法测定，计算连翘苷和连翘酯苷的含量。
    3 讨论
    3．1 连翘酯苷为本室自制，采用聚酰胺加压柱色谱法进行初步分离，可有效地与其他成分分开，再用葡聚糖凝胶柱纯化，用甲醇及水系统洗脱，可得到良好晶形的连翘酯苷。连翘酯苷很不稳定，在制备过程中，条件偏酸或偏碱以及温度过高，都易引起分解。使用时，溶液配制后应立即用黑纸包裹，放于冰箱内储存，以免分解。
    3．2 在连翘成分分析方面前人已打下坚实的基础，本研究在此基础上所建立的连翘苷的分析方法，样品预处理简便，也同样适用于连翘药材中连翘苷含量的测定；在连翘酯苷的HPLC分析过程中，加入少量冰醋酸，连翘酯苷的峰形得到很好的改善，测定时使用YWG-Cl8柱，采用乙腈-水-冰醋酸为流动相，具有广泛的实用价值。
    3．3 本研究采用高效液相色谱方法，选用连翘酯苷和连翘苷作为指标性成分，对连翘病毒清胶囊中有效成分进行含量测定，并分别对精密度、稳定性、重现性和回收率进行了考察。实验结果表明所建立的方法稳定、准确、可靠，能有效控制连翘病毒清胶囊的内在质量，为该制剂的进一步研究开发奠定了基础。

RP-HPLC测定天乐口服液中橙皮苷的含量1　实验部分 
1.1　仪器与试药 
　　日本岛津LC-10AD高效液相色谱 仪，SPD-10A紫外可见检测器，C-R3A数据处理机；岛津UV-260型可见紫外分光光度计；TGL-16B高速台式离心机。橙皮苷对照品(自制，含量99.52%)；乙腈(色谱纯，上海生化化工助剂厂)；其余化学试剂均为分析纯。
1.2　检测波长的选择 
　　取橙皮苷对照品，用所选流动相作溶剂，制成适宜浓度，在200～400 nm波长范围内测定吸收光谱，橙皮苷在流动相中的最大吸收波长为284 nm。 
1.3　色谱条件 
　　经多次试验，选择μ-Bondapak C18柱(10μm,4.6 mm×250 mm，大连物化所)；以2%甲醇的乙腈溶液-0.1%磷酸和0.1%三乙胺的水溶液(20∶80)为流动相；流速1.2 ml/min；柱温40℃；检测波长284 nm。 
　　在上述条件下由橙皮苷对照品，缺陈皮供试品(空白)、及天乐口服液供试品的色谱图可见，被测成分分离完全，供试品中共存组分不干扰橙皮苷的测定。
1.4　标准曲线测定 
1.4.1　对照品溶液的配制　取橙皮苷对照品约10 mg，精密称定，置200 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取适量，用甲醇稀释成每1 ml中含6、12、18、24、30 μg橙皮苷对照品的溶液，经高速离心后即为对照品溶液。
1.4.2　标准曲线的测定　取不同浓度的对照品溶液，进样20 μl，记录色谱图。以峰面积与浓度绘制标准曲线，其回归方程为：
y=1897.9+38397.6x　r=0.9999(n=6)。 
　　结果表明，橙皮苷在6～30 μg/ml浓度范围内与峰面积有良好的线性关系。
1.5　回收率试验 
　　分别取已测定含量的供试品6份，各加入一定量的橙皮苷标准溶液，按上述供试品的测定方法测定，计算加样回收率，结果见表1。
1.6　精密度考察 
　　取橙皮苷对照品溶液20 μl，照上述色谱条件，按每次测定的峰面积值计算，测定结果为218090、217454、218173、219925、220323，平均峰面积值为218793，RSD=0.57%(n=5)。

1.7.1　供试品溶液的制备　精密量取供试品溶液1 ml，置50 ml量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，经高速离心即为供试品溶液。
1.7.2　分离测定　取供试品溶液，进样20 μl，在上述条件下测定，记录色谱图和橙皮苷峰面积，按回归方程或随行标准计算供试品中橙皮苷含量.
2　小结 
　　以上试验对检测条件、回收率及供试品的稀释液等进行了探索。用RP-HPLC测定天乐口服液中橙皮苷含量，操作简便，供试品中共存组分不干扰测定，结果准确可靠，可作为该制剂中橙皮苷的质量控制方法。
RP-HPLC法测定金钱草中槲皮素和山奈素两种黄酮成分的含量    金钱草为报春花科多年生草本植物过路黄(Lysimachia christinae Hance)的全草；清利湿热、通淋、消肿。为热淋、石淋、黄疸、疮毒之要药，煎剂有显著利尿作用，并能促进胆汁从胆管排出，有排石作用。抗菌实验对金黄色葡萄球菌有抑制作用，金钱草总黄酮及酚酸有抗炎作用。茎叶主要含酚性成分、甾醇、黄酮类、氨基酸、鞣质、挥发油、胆碱等；根含皂苷。除用聚酰胺柱分离了槲皮素和山奈素等5种黄酮类成分的报道外，对其单成分含量测定的方法在文献中少见报道。    我们应用RP-HPLC法对其中的两种黄酮成分进行含量测定，为质量标准研究提供科学依据。
    1 仪器与试药
    瑞士Mettler Toledo AG285电子天平；DZF-1真空干燥箱；ZQ-250超声波清洗 器；美国安捷伦公司高效液相色谱 仪Agilentl100 Series，配置四元泵，自动进样器(进样范围为0.1～100μ1)，紫外可见光检测器，柱温箱，在线真空脱气泵，色谱工作站等。
    槲皮素和山奈素对照品均由中国药品生物制品检定所提供；金钱草购自四川，经鉴定为报春花科过路黄的全草，符合《中国药典}2000版一部规定；甲醇为色谱纯；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。
    2 方法与结果
    2．1 色谱条件和系统适应性
    色谱柱：Alltima Cl8柱(150mmX4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-水-磷酸(500：500：1)(0.45μm微孔滤膜滤过，用前超声脱气)；检测波长：360nm；柱温：30℃：流速：1.0ml/min。
    在此色谱条件下，测得槲皮素(Q)、山奈素(K)对照品贮备液和供试品溶液色谱图.
    可见槲皮素(Q)峰的保留时间约为9.8 min，山奈素(K)峰的保留时间约为18.1min；图Q、K两峰与相邻峰分离度均大于1.5，理论塔板数分别为3700和6229。
    2．2 溶液的配制
    2．2．1 对照品溶液的配制 精密称取经五氧化二磷干燥过夜的槲皮素(Q)和山奈素(K)对照品适量于同一量瓶中，加甲醇制成每毫升含0.Olmg的混合溶液，作为对照品贮备液(Q为1.065 X 0.01mg/ml，K为1.084X 0.01 mg/ml)。

    2．2．2 供试品溶液的制备
    精密称取经粉碎的金钱草粉末2g于三角烧瓶中，加入25ml甲醇，超声处理30min，放冷至室温，用中速分析滤纸滤过，吸取续滤液20ml置分液漏斗中，用石油醚(20ml，15ml，15ml)萃取3次，除去其中的脂溶性杂质后，合并下层液，用乙酸乙酯-水(15：lO)混合液25ml分3次萃取，合并萃取液，回收乙酸乙酯，残渣加甲醇溶解并转移至25ml量瓶中，加甲醇至刻度，用O.45μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液，备用。
    2．3 标准曲线的制备
    倾取上述对照品贮备液置样品瓶中，以0.3、0.5、1、2,4、6、8、10、15μl体积进样，按上述色谱条件进行测定，分别以槲皮素(Q)和山奈素(K)进样量为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，得回归方程分别为：
    槲皮素(Q)：Y=37292X，r=0.9999，线性范围为：3.195×0.001～0.15975μg
    山奈素(K)：Y=39597X，r=0.9999，线性范围为：3.252×0.001～0.1626μg
    结果表明槲皮素(Q)和山奈素(K)分别在3.195×0.001～0.15975μg和3.252×0.001～0.1626μg范围内，对照品进样量和其峰面积积分值具有良好的线性关系。
    2．4 精密度试验
    精密吸取上述对照品贮备液1OμL，按“样品测定”项下方法操作，重复进样6次，结果测定Q、K峰面积积分值，RSD分别为0.30％和0.31％(n=6)。
    2．5 重复性试验
    取金钱草粉末，按照“供试品溶液制备”方法制备5份，按照“样品测定”项下方法操作，含量测定。
    计算得Q和K的RSD分别为1.12％和0.31％(n=5)。
    2．6 稳定性试验
    精密吸取新制备的供试品溶液10 ，按“样品测定”项下方法在25℃温度下每隔1 h测定1次，共测定12次，记录峰面积，结果12次进样Q和K峰面积的RSD分别为1.91％和O.44％，表明供试品溶液在12h内稳定(n=12)。
    2．7 加样回收率试验
    精密称取已知含量的样品3份，分别加入同法制备的对照品贮备液(Q为0.8224×0.001mg/ml，K为1.030×0.001 mg/ml)1.0ml、1.0ml、1.5ml，按照“供试品溶液制备”方法处理，按上述色谱条件测定.
    2．8 样品测定
    按“2．2．2”项方法制备金钱草供试品溶液，按上述色谱条件测定，3批样品测定结果。
    3 讨论
    3．1 流动相的选择。因为金钱草中的黄酮类成分含有酚羟基，呈弱酸性，故选择酸性缓冲系统。分别比较了甲醇-水-磷酸(500：500：1)系统、乙腈-水-磷酸(330：670：1)系统、甲醇-乙腈-水-磷酸(150：165：335：1)系统，结果表明后两系统在不同流速下供试品色谱峰呈现不同程度的前沿或拖尾现象。使用甲醇-水-磷酸(500：500：1)系统不但可以得到良好的峰形，而且目标峰与其相邻色谱峰的分离度良好，因此选择该系统作为流动相。
    3．2 提取溶剂的选择。分别比较了甲醇、50％ 甲醇、60％甲醇、7O％甲醇及95％乙醇、5O％乙醇、60％乙醇、70％乙醇作为提取溶剂同法处理药材粉末，含量测定结果表明，选用甲醇时峰形最好，且目标物含量较高，故选用甲醇作为该方法的提取溶剂。
    3．3 提取方法的选择。分别比较了4种提取金钱草粉末的方法：①超声波提取3O分钟后不经其它溶剂处理，直接过滤进样；②超声波提取3O分钟后，过滤，精密吸取续滤液1Oml，加25％盐酸15ml，回流提取3O分钟，加甲醇至50ml；③超声波提取3O分钟后，过滤，精密吸取续滤液2Oml置分液漏斗中，用石油醚(20ml、15ml、15m1)萃取3次，除去其中的脂溶性杂质后，合并下层液，用乙酸乙酯．水(15：lO)混合液25 lTl1分3次萃取，合并上层液，混匀，精密吸取10ml，加25％盐酸15ml，回流提取3O分钟，加甲醇至5Oml；④ 同“2．2”供试品溶液的制备。结果①法目标物含量虽高，但干扰较大；② 、③法目标物含量最高，但回收率不高，且考虑到黄酮苷在酸性条件下水解转化为苷元，结果要涉及到总黄酮的换算，实际工作嫌复杂；④ 法干扰小，目标物回收率较高，可以较真实的反映该生药中槲皮素、山奈素两种黄酮成分的含量，故选择④法测定。

RP-HPLC法测定人血浆中利福喷丁的浓度利福喷丁(rifapentine)是一种新的长效利福霉素类抗生素，对结核杆菌具有良好的抗菌作用。与临床应用广泛的一线抗结核药利福平相比，其抗菌谱相似，但抗结核杆菌作用要高2—10倍，po不良反应更少，血浆中消除半衰期更长，且细胞色素P450诱导效应也稍小，但其肝毒性仍较大，尤其在肝脏损伤的结核患者中更存在明显的个体差异，用经验剂量较难反映出临床疗效，故有必要对利福喷丁的血药浓度进行监测。目前，国内外关于利福喷丁血药浓度检测的文献记载较少，并且方法繁琐，操作费时 ，本文建立了一种简便快速、可靠的RP．HPLC法，以检测血浆中利福喷丁的浓度。

1 仪器与试药
    利福喷丁胶囊(四川I乐山三九长征药业股份有限公司生产，150 me,／粒，批号：20030407)；利福喷丁对照品由四川省抗菌素工业研究所药理室提供；内标：利福平(含量>99．6％ ，由四川省抗菌素工业研究所药理室提供)；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
Agilent 1100高效液相色谱 仪(美国惠普公司)，威玛色谱数据工作站(威玛龙公司)；ZORBAX SB-C 色谱柱(4．6mm×250 mm，5μm，美国惠普公司)；LDZ4-0．8高速离心机(北京医用离心机厂)；SB3200超声仪(上海必信医疗器械厂)。

2 方法与结果
2．1 色谱条件
    色谱柱：ZORBAX SB-ODS 柱(4．6 mm×250 mm．5μm)，柱温：40℃ ，流速：1．0 ml/min，进样量：20μl，流动相：甲醇 0.02 mol/L 磷酸缓冲液(67：33，V／V；pH 7．0)，检测波长340 nm：内标：利福平。
2．2 血浆样品处理：取血浆样品0．5 ml，精密加入0．2 mg/ml 利福平内标液20μl，混匀，6 ml二氯甲烷分2次加入，每次3 ml，每次漩涡混匀30 S，3 000 rpm离心5 min，分取二氯甲烷层，常温下氮气吹干，200 l流动相溶解残渣，过滤后进样20 l，色谱图见图1。利福平和利福喷丁的保留时间分别为3．1和4．1
2．3 标准曲线的绘制：精密量取空白血浆0．5 ml，分别加入不同体积的利福喷丁对照品液配制成0．54，1．08，2．16，4．32，8．64，l7．28 ml 系列浓度，再精密加入利福平内标液20 l，混匀，按“血浆样品处理”项下操作，以利福喷丁浓度(c)为横坐标，利福喷丁与利福平峰面积比为纵坐标(Y)作图，得利福喷丁的标准曲线方程：Y=0．08C+0．013(n=6，r=0．999 5)，最低检测限为0．54 μg/ml。
2．4 相对回收率及精密度试验：按照标准曲线制作方法，在l d内于不同时间或连续3d处理并测定利福喷丁浓度为0．54，4．32和l7．28 g/ml的血浆样品，按“血浆样品处理”项下操作，测定其日内变异、日间变异及回收率，结果见表l。
2．5 稳定性考察：取已知浓度的利福喷丁血浆样品数份，分别置室温(0，2，4，8，12 h)、冰融(0，4，8，l2，24 h)、冰冻(0，7，14，2l，28 d)条件下存放不同时间后，按“血浆样品处理”项下方法操作，测定利福喷丁含量，考察样品稳定性。结果表明利福平在室温条件下至少能稳定8 h，在冰融(4℃)条件下至少能稳定24 h，在冰冻(一24℃)条件下至少能稳定28 d。
2．6 患者利福喷丁血浆浓度测定：结核病患者6例，其中男性5例，女性l例，年龄22—48岁，体重48—72 kg，抽取空白血后，顿服利福喷丁600 mg。于服药后l，2，4，6，8，l2，l6，24，36，48，72 h分别抽取静脉血置肝素管中，离心，分离出血浆，置一24℃保存。按“2．2”项下方法测定利福喷丁浓度，受试者的平均药-时曲线见图2。

3 讨论
    利福喷丁样品处理过程中，常温下尽可能完全除去二氯甲烷，因为二氯甲烷的存在会出现峰分裂现象：内标利福平遇光易分解，操作时尽可能避光、快速。在以上色谱条件下，主峰、内标峰及杂质峰均能得到完全分离，峰形良好，且主峰时间适宜。
6例结核病患者血药浓度测定结果表明：利福喷丁口服吸收安全，血药浓度较高，约8 h血药浓度达到峰值，C ：(15．01±2．02)/m1，48 h血药浓度尚有(4．82±1．86)g/ml，tl 2=(16．22±2．08)h，与文献报道结果基本一致
Agilent1100高压液相色谱仪基本操作步骤(一)、开机：
1、打开计算机,进入Windows NT （或Windows 2000）画面,并运行Bootp   Server程序。
2、打开 1100 LC 各模块电源。
3、待各模块自检完成后，双击Instrument 1 Online图标，化学工作站自动与1100LC通讯，进入的工作站画面。
4、从“View”菜单中选择“Method and Run control”画面, 单击”View”菜单中的“Show Top Toolbar”，“Show status toolbar”，“System diagram”,”Sampling diagram”，使其命令前有“√”标志，来调用所需的界面。
5、把流动相放入溶剂瓶中。
6、打开Purge阀。
7、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Setup pump选项，进入泵编辑画面。
8 、设Flow：5ml/min，单击OK。
9、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Pump control选项，选中On，单击OK，则系统开始Purge，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止,切换通道继续Purge，直到所有要用通道无气泡为止。
10、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Pump Control选项，选中Off，单击Ok关泵， 关闭Purge valve。
11、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Setup pump选项，进入Pump编辑画面，设Flow：1.0ml/min。
12、单击泵下面的瓶图标，输入溶剂的实际体积和瓶体积。也可输入停泵的体积。单击Ok。

（二）数据采集方法编辑：
1、开始编辑完整方法：
●从“Method”菜单中选择“Edit entire method” 项，如上图所示选中除“Data analysis ”外的三项，单击Ok，进入下一画面。

2、方法信息：
●在“Method Comments”中加入方法的信息（如：方法的用途等）。
●单击Ok 进入下一画面。

3、泵参数设定：（以二元泵为例）
●在“Flow”处输入流量,如1ml/min，在“Solvent B”处输入70.0,(A=100-B) ,也可Insert 一行”Timetable” ,编辑梯度。在“Pressure Limits Max”处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子。
● 单击Ok进入下一画面。

4、自动进样器参数设定:
●选择合适的进样方式, 进样体积 1.0ul ,洗瓶位置为6号。“Standard Injection”----只能输入进样体积，此方式无洗针功能。“Injection with Needle Wash”----可以输入进样体积和洗瓶位置，此方式针从样品瓶抽完样品后，会在洗瓶中洗针。“Use injector program”---可以点击Edit 键进行进样程序编辑。
●点击Ok进入下一画面。

5、柱温箱参数设定:
●在”Temperature”下面的方框内输入所需温度,并选中它,点击”more>>” 键,如图所示,选中”Same as left”---使柱温箱的温度左右一致。
●点击ok进入下一画面。

6、VWD检测器参数设定:
●在”Wavelength”下方的空白处输入所需的检测波长,如254nm, 在”Peak width (Response time)”下方点击下拉式三角框,选择合适的响应时间, 如>0.1min (2s)。●在Timetable 中可以“Insert”一行，输入随时间切换的波长，如1min ，波长=300nm。点击ok进入下一画面。

7、DAD检测器参数设定:

●检测波长: 254nm,BW=30nm, 参比波长=350nm,BW=100nm;
●检测波长：一般选择最大吸收处的波长。样品带宽BW： 一般选择最大吸收值一半处的整个宽度。参比波长：一般选择在*近样品信号的无吸收或低吸收区域。参比带宽BW：至少要与样品信号的带宽相等，许多情况下用100nm作为缺省值。Peak width（Response time）：其值尽可能接近要测的窄峰峰宽。Slit—狭缝窄，光谱分辨率高；宽时，噪音低。同时可以输入采集光谱方式，步长，范围，阈值。选中所用的灯。
●点击Ok进入下一画面。

8、RID检测器参数设定:
●色谱条件:
进样体积: 20ul 。 光学单元温度: Off 。
极性: 正 。 峰宽(响应时间) : 4s 。
●“Optical Unit Temperature”---若环境温度控制在±2℃,设定为Off, 若环境温度不稳定,则设定光学单元温度为高于环境温度5度,以防样品在池中沉淀。“Peak width”---大多数分析设为4S，只有在高速分析下设为更短。“Automatic recycling after analysis”---在不进行分析时可以让流动相循环，节省流动相，检测器连续运行，可随时投入使用。
●点击RID图标，选择RID Control ：Heater 设为On，若要循环流动相，必须将“Recycling Valve”设为ON。手动purge 参比池，将其设为On，并输入Purge 时间。

9、FLD检测器参数设定:

色谱条件：
● 样品：P/N 01018-68704 用甲醇稀释为1:10。
● 进样体积：5ul。
● 柱温箱: 30℃ 。 EX=246nm, EM=317nm ,PMT=10。
● 响应时间=4s. 停止时间： 出峰完毕。
● Excitation A: 激发波长:200-700nm,步长为1nm,或Zero Order。
● Emission: 发射波长: 280-900nm, 步长为1nm,或Zero Order。
● PMT: 大多数应用适当的设定值为10,若高浓度样品峰被切平头,则减少 PMT 值。
● “Peak width”：大多数应用设为4s，只有快速分析采用小的设定值。
● Multi Ex ： 多波长及光谱（激发）。
● Multi Em：多波长及光谱（发射）。
● 同时可以输入范围Range、步长step、采集光谱。
10、在“ Run time checklist ”中选中“Data acquisition”，单击Ok。
11、单击“Method”菜单，选中“Save method as”，输入一方法名，如“test”，单击Ok。
12、从菜单 “View”中选中”Online signal” ,选中Windows 1,然后单击Change 钮,将所要绘图的信号移到右边的框中,点击Ok.(如同时检测二个信号,则重复12,选中Windows 2)。
13、从“Run control ”菜单中选择“Sample info”选项，如上图所示，输入操作者名称，在“Data file ”中选择“Manual”或“Prefix”。区别: Manual--每次做样之前必须给出新名字,否则仪器会将上次的数据覆盖。Prefix—在Prefix 框中输入前缀，在Counter 框中输入计数器的起始位，仪器会自动命名，如vwd0001，vwd0002……。
14、从Instrument 菜单选择System on。
15、等仪器Ready，基线平稳，从Method菜单中选择“Run method”，进样。