血蓝蛋白活化及其与多肽抗原耦联实例

 在制备多肽抗体的过程中，需要制备多肽抗原。但是由于多肽分子小，免疫原性弱，需要和大分子蛋白耦联。现在业内比较通用的是将多肽和活化的血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin,KLH）耦联后作为抗原同凿剂等比混和注射给免疫动物。但是活化的血蓝蛋白价格和未活化的相差 4-5倍，本人发现活化血蓝蛋白不是太复杂，如果能自己活化，可以节约不少费用。因此，本文将介绍如何活化血蓝蛋白以及如何将活化血蓝蛋白和多肽相连。

 

1. 试剂

mcKLH: Mariculture Keyhole Limpet Hemocyanin(Fig. 1)

Purification Buffer Salts (Fig. 2)

Sulfo-SMCC: Sulfosuccinimdyl 4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxylate)(Fig. 3)

DMSO:Dimethyl Sulfoxide,二甲亚砜（Fig.4）

PD-10 column：去盐柱（Fig.5）

[Agr14]-ET(15-21):本人合成的多肽片段，分子量约1054,用于制备抗内皮素抗体。
 
Fig.1 mcKLH

 

Fig.2 Purification Buffer Salts

 

 
Fig. 3 Sulfo-SMCC                                 Fig.4 DMSO

 

 
Fig.5 PD-10 column
 

 

2. 步骤

2.1 活化mcKLH

2.1.1 将冷冻保存于冰箱的Sulfo-SMCC（Fig.3）取出后放在室温，直到和室温相同（因为该试剂对水敏感，应避免由于冷热接触产生水气）。称取5 mg该试剂，加入1ml去离子水，涡旋溶解。

2.1.2 在一瓶mcKLH（20mg，Fig.1）中加入1ml去离子水，然后手动缓慢旋转瓶子使其溶解（注意千万不要用太激烈的方式振荡溶液）。

2.1.3 将溶解的Sulfo-SMCC溶液全部转入mcKLH溶解的瓶中，用手轻摇混和后放在振荡器上室温反应1h（Fig.6）。

Fig.6 在振荡器上活化mcKLH

 

2.1.4 溶解purification buffer salts：将60ml 去离子水加入白色purification buffer salts瓶（Fig.2）中，溶解后备用。

2.1.5 纯化活性mcKLH和去除多余MSCC:将PD-10 column（已经反复使用过的）装满去离子水洗全柱2次后，用purification buffer洗两次。准备15个干燥、干净的5ml玻璃试管，将清洗过的PD-10 column放在左边第1试管上，加入0.5ml反应后的mcKLH溶液，等液体都流入第1个试管后，将PD-10 column移到第2个试管,再加入0.5ml反应后的mcKLH溶液，以此类推，直到反应液加完（注意反应液总共加入量不能超过2ml，因为2ml以后，即第5个试管就有蛋白从column流出了）。然后将column移到下一个试管，加入0.5ml purification buffer，直到第15个试管（Fig. 7）。

Fig.7 从左向右试管移动column

 

2.1.6 将滤出液显蓝色的第6到12试管液体收集到一个试管，共计3ml（Fig.8）。将给混和液根据每次使用剂量，分装到dorf管，液氮冷冻后保存于－70度冰箱，备用。（本次试验由于我们计划用2ml该液，所以只取出1ml 保存）

Fig.8 肉眼可见从6-12管液体为蓝色

 

2.2 活化mcKLH和多肽耦联

2.2.1 称取7mg [Agr14]-ET(15-21)在5ml玻璃试管中。本次试验用7mg是基于以下原理：为了完全和有效耦联，使用的半抗原（例如多肽）摩尔数一定要多余携带蛋白（mcKLH）,例如，一个半抗原分子量是2000dalton的需要2mg（约1umol）加入2mg （约0.7 umol ）携带蛋白中。由于本试验用的多肽[Agr14]-ET(15-21)分子量约为1000dalton，而且计划用14mg（2ml活化mcKLH），所以就需要多肽7mg（即1:0.7 摩尔数）。

2.2.2 用一个移液枪吸取0.5ml DMSO （在最终耦联总液中量不能超过30%，如果过多，会引起mcKLH蛋白变性）,然后再用另外一个移液枪吸取20ul 0.5M EDTA (PH8.5,用于减少反应过程中氧化的发生)备用。首先向含7mg多肽试管加入0.5ml DMSO，混匀，溶解多肽后，再加入2ml 活化的mcKLH,然后迅速加入20ul 0.5M EDTA，用移液枪反复轻轻混匀液体后将该试管放到振荡器上室温摇至少2h（也可以过夜）（Fig.9）。

Fig.9 将多肽和活化mcKLH试管放在振荡器上摇2小时以上

 

2.2.3 将反应后多肽和活化mcKLH试管中反应液多次转移到一个1.5ml dorf管，10000转/min离心3min后小心吸出上清到另外一个5ml玻璃试管，可见dorf管中有约0.5ml体积的沉淀物（沉淀物多少决定于多肽的不同）（Fig.10）。该沉淀物主要就是多肽和活化的mcKLH耦联物。

Fig.10 dorf管中沉淀的淡蓝色多肽和活化的mcKLH耦联物

 

2.2.4 去除上清中的EDTA和DMSO:由于EDTA和DMSO如果注射给动物，对动物有害，所以需要去除。本试验依然采用2.1.5的方法用盐析柱去除上清液中的EDTA和DMSO。最后收集第6-12管液体，约3.5 ml同Fig.10中的沉淀混匀后，体积约4ml，将该溶液混匀后分成7等分（因为我们计划要免疫2只兔子和2只母鸡，总共免疫7次），每次免疫用一份免疫4只动物。

（动物第一次免疫已经在2011年12月31日进行，最终免疫结果如何，还得等一个半月后检测抗体滴度）