多肽固相合成实例－neuromedin B-10(现学现卖)

多肽固相合成实例－neuromedin B-10(现学现卖)

   由于研究需要多肽neuromedin B-10(NMB-10)，在导师的指导下合成了该多肽。由于本人也是初学者，对有些机理不是很清楚，但是可以转述导师的观点。用Fmoc固相法合成[Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl) solid-phase peptide synthesis,SPPS]该多肽的详细过程如下。

 

图1 牛neruomedin B 氨基酸序列。第一排是牛gastrin－releasing peptide（GRP）的氨基酸序列，GRP(23-32)又名neuromedin C（NMC）,是个十肽，它们和NMB都是属于bombesin family。方框中的是NMB,红色标出的是NMC和NMB不同的氨基酸。蓝色标记的是我们要合成的两个多肽NMB-10以及N－末端加个Cysteine用作半抗原的Cys-NMB-10.另外需要注意的是该多肽C－末端amide，即有个－NH2。
 

1 材料

1.1 树脂（resin）的选择：由于NMB的C－末端amide，所以我们选择的树脂是Rink Amide MBHA resin  ( Loading: 0.70 mmol/g resin=1.429g/mmol,100-200 mesh),据导师经验用MBHA resin最后的多肽产出率高。本次合成我们要用0.5 mmol resin＝714.5mg（0.5/0.70）。

1.2 其他一些化学试剂见图2

 

图2 需要用的化学试剂和量。括号中的“eq”指的是摩尔倍数相对resin摩尔数。

 

1.3 各个氨基酸用试剂量如图3.

图3 各个氨基酸用试剂量。根据各个Fmoc－氨基酸的分子量计算本次合成需要用多少mg各个氨基酸。从图2可知我们氨基酸用量是resin的2.5倍（其实产品说明上建议的是5倍，在我们实验室的多肽合成中各个试剂相对resin用量都减半了，原因很简单导师经验是2.5倍依然有很高的多肽产出率），即resin用0.5mmol，那么个个氨基酸用0.5mmol×2.5＝1.25mmol。再根据Fmoc氨基酸的分子量（在产品目录上查的）计算需要多少mg。带圈数字表示往一个试管（5ml玻璃试管）中加物质的顺序。例如，先加HOBt（因为该试剂最忌讳被氨基酸污染，如果混入氨基酸据说该粉剂就不可用了，所以要先称后再称其他试剂），然后是HBTU(该试剂只有红色标记的氨基酸需要加，因为它们都含Trt)，最后才称和加入Fmoc-氨基酸。这三种粉末称量完后将各个试管用封口膜封口，并放在有干燥剂的容器中备用。试剂4都是液体要在合成当天加入。 另外，11C 是用于合成半抗原的，本次计划仅将1/10的含resin多肽（即多肽链接到10G 后）进一步合成半抗原，所以11C 仅需其他氨基酸的1/10量（1.25mmol/10×585.71＝73mg）。
 

1.4 洗涤试剂：DMF〔N,N'-Dimethylformamide(日本和光纯，Wako)〕

1.5 去Fmoc保护基试剂：Piperidin/DMF(即P/D=1:9体积)

 
 

2 合成过程

2.1去除rsein的保护基Fmoc

2.1.1膨胀resin：将714.5 mg resin放在干燥的10ml安培瓶中（图4），加入5-10ml DMF并将安培瓶加盖（在多肽合成过程中忌讳有水，防止空气中水分进入），用磁力搅拌器搅拌（注意本次合成中搅拌如果不特殊提及，即指磁力搅拌，注意转子不能太大，以免破坏resin），至少需要30min时间。在等待的过程中可以将一天需要链接的各个Fmoc－氨基酸溶解。

 图4

 

2.1.2 溶解Fmoc－氨基酸：按照图3，将1M,2F,4G,5T,6A,7W,8L（一天链接1-8氨基酸）试管中分别加入1mL DMF,涡旋混匀（其中2F中加1mL DMF后成胶状，所以又加了0.5mL DMF,混匀后稍微溶解，但依然还是有些如石头不溶解的；4G中又另加了1mL DMF;7W加入1mL DMF后整个成团，如石头，液体清亮，但逐渐溶解，液体显淡黄色；8L易溶解，液体淡黄色）。3H，9N和11C因为含有Trt，所以需在链接前溶解（3H加2ml DMF,如白石头，大概涡旋后10min溶解（不清亮），再加EDIPA,稍微混匀后迅速加入含resin的反应管；9N加了2ml DMF;11C 中加入了3ml DMF,很快溶解，清亮，后加EDIPA很快成淡黄色。）。

2.1.3 去除resin的Fmoc：将膨胀后的resin转入有滤网的反应管中，抽虑去DMF,剩下的resin体积约4ml。加入等体积P/D（4 ml）洗涤resin，轻轻抽吸（图5）后再加入4 ml P/D,用不锈钢小药勺混匀（图6）后静止5 min（图7）。

   
                 图5                               图6                         图7 

 

2.1.4 检测Fmoc是否去除：在一个10mL 离心管加入0.7mL (1-2mL CH₃COOH in 50mL Methanol),加入0.5uL 5min后的2.1.3液，稍微手动混匀后1-2min离心，弃去液体（注意不要将resin颗粒倒出），加入0.7mL (30mL CH₂Cl₂/20mL Methanol)，稍微手动混匀后1-2min离心，弃去液体；加入33uL （4g phenol in 1mL ethanol），再加入67uL 95% pyridine和25uL Ninhydrin(水合茚三酮)；涡旋混匀后水浴加热5min。如果显蓝紫色，则说明Fmoc被去除（即去保护）（图8）（9N即使去除了Fmoc，仍然有点发蓝）。然后将此反应液加入一个5mL 玻璃试管，并用约400uL 60％ethnal洗涤离心管，并将洗涤液一并转入5mL 玻璃试管中，混匀后静置在试管架（图9）以备对比。

 

                        图8                                              图9

 

2.1.5 然后用同体积DMF洗涤去保护的resin三次，将resin和DMF混合液转入一个小烧杯中，磁力搅拌（注意转子不要太大，以免打坏resin），迅速加入溶解好的1M(即第一个氨基酸met)液；磁力搅拌15min后，按照2.1.4的方法检测Fmoc氨基酸（1M）是否耦联在resin上。如果耦联上了2.1.4颜色反应是无色的，如果还有蓝色，说明反应时间不够，需延长时间，继续检测，直到基本无蓝色为止（10G需要20min反应）。

2.1.6 去除链接在resin上Fmoc－氨基酸的Fmoc：确定Fmoc－氨基酸已经耦联在resin后，将该resin液全部移到有滤网的反应管（该管在一个抽虑瓶上）中，抽吸出DMF,然后用同体积DMF洗涤三次，再用同体积P/D洗涤一次，后加入同体积P/D（去Fmoc保护），用不锈钢小药勺混匀后静止5 min。检测Fmoc是否去除方法同2.1.4，如果显蓝紫色说明Fmoc去除了，进入下一个循环2.1.5。颜色反应结果如图10

图10 （说明：右边是颜色反应结果；左边是氨基酸连接情况，最左边有“－”说明去Fmoc保护，如果只有氨基酸说明链接上了相应的Fmoc－氨基酸）

 

从图11 中左起第三个试管是3H(即第三位Fmoc－His（Trt)）和9N在去除Fmoc保护后的蓝紫色很浅，而且resin颗粒成铁锈红色，在其他多肽合成中该氨基酸颜色反应相同。

 2.1.7 在10G（NMB的N－末端最后一个氨基酸）连接到resin后，用DMF洗三次后，转入一个量筒，再加DMF至25ml，磁力搅拌情况下取出2.5ml（1/10）到一个小的反应管，用于继续连接11C，合成NMB多肽半抗原，用于产生NMB-10抗体。

2.1.8 在N－末端最后一个氨基酸去Fmoc保护后，用DMF洗涤4次，再按照以下1-11试剂顺序（如图12）洗涤resin。每种液洗两次，洗液量是resin体积的两倍左右。

图12 N－末端最后一个氨基酸去Fmoc后洗涤顺序
 

2.1.9 洗涤后，resin转入一个已经提前称量空管重的10ml玻璃管，真空冷冻干燥，过夜。干后称重（本次含NMB－resin重1.4321g，Cys－NMB-resin重0.1772g），－20℃保存，以备去DMF和用HPLC纯化。