超滤管的作用:
1)浓缩;2)脱盐;3)换Buffer;4)具有部分纯化的效果。
1、新的超滤管可以直接使用,不需要其他处理;
2、超滤管不能高温灭菌;
3、换浓缩蛋白时超滤管的处理
超滤管可以重复使用,用0.1M的NaOH浸泡1-2h,用水清洗,再在离心机上用相关溶液(灭菌水或PBS)清洗3次,即可用于浓缩新的蛋白;
4、平常放置超滤管的处理
经常使用的超滤管,在用0.1M的NaOH浸泡1-2h,用水清洗,用灭菌水浸泡,务必保持滤膜润湿,不能长菌;
5、长时间放置超滤管的处理
较长时间不使用的超滤管,在用0.1M的NaOH浸泡1-2h,用水清洗,用20%的乙醇浸泡保存,务必保持滤膜润湿,不能长菌;
6、超滤管使用的离心转速
离心转速一般采用4000rpm(一般建议为3000g,最大不能超过4000g)离心5-8分钟,即可将4ml样品浓缩至1ml以下至几十微升;速度过高,目的蛋白会离下,导致目的蛋白丢失;速度过低,耗时,工效低;
7、枪头伸入超滤管中时注意事项
加蛋白液或Buffer到超滤管时,可以用蓝枪头;但从超滤管底吸取浓缩好的目的蛋白时,必须用黄枪头;用枪头伸入超滤管中时,必须防止碰到滤膜,以免戳破滤膜;
8、减少超滤管对蛋白的吸附损失
超滤管的滤膜能吸附蛋白,会导致目的蛋白减少可达30%左右;为减少蛋白损失,在吸尽目的蛋白液后,再用蛋白Buffer吹洗超滤管的管底,可以将滤膜吸附的蛋白洗下大部分而减少目的蛋白的损失;如纯化的蛋白较浓时,注意浓缩的体积不可过小;一般无论如何离心,底部会保留有200 µl左右的蛋白液;
9、如何界定超滤管失效
在正常使用下,滤膜没有被戳破时,浓缩蛋白液中不含有蛋白或量很低(包括目的蛋白),而第一次的滤下液中含有目的蛋白,则说明滤膜失效,需要换新的超滤管。
不同MWCO的离心速要求不同。
当然转速越大,时间越长,透过就越多。
而且速度也和料液性质有关,一般只能根据你的蛋白溶液进行试验,看flux是多少,而且随着透过体积增加,flux会逐渐降低。
以使其达到想要的浓缩倍数。sartorius的离心管保证有最小体积不会滤干,具体要看不同的厂家。
离心条件说明书上应该有推荐值,一般至少要3000g以上,注意控制过程中的温度以保证蛋白活性。
可以反复用几次,次数多了就不行了,管和膜都可能会破。
不用的时候,20% EtOH保存以免长菌。